Validation d'une méthode analytique : guide pratique pour le laboratoire

Validation d’une méthode analytique : guide pratique pour le laboratoire

Système HPLC et fioles d’échantillons en laboratoire

Valider une méthode analytique, c’est démontrer, preuves à l’appui, qu’elle donne des résultats corrects et fiables pour l’usage précis auquel vous la destinez. Cela passe par un plan écrit, des essais mesurant des critères de performance (exactitude, précision, linéarité, limites de détection et de quantification), des critères d’acceptation fixés à l’avance et un dossier qui garde la trace de tout. Voici comment procéder, étape par étape, avec les repères publiés au Canada et à l’international.

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En bref

La validation confirme que les performances d’une méthode répondent aux exigences spécifiées et qu’elle convient à l’usage prévu, selon le Conseil canadien des normes.
La vérification est plus légère : elle montre que votre laboratoire atteint les performances déclarées d’une méthode déjà validée.
La répétabilité se mesure dans les mêmes conditions sur une courte période (par exemple 6 déterminations à 100 % de la concentration test). La reproductibilité exige un essai inter-laboratoires.
L’étendue de la validation et les critères d’acceptation se décident dès le départ, en fonction de l’usage et des besoins du client.

Table des matières

Ce que valider veut vraiment dire
Un cycle de vie, pas un événement unique
Validation ou vérification : où se situe la frontière
Les critères de performance à évaluer
Évaluer la répétabilité
Évaluer la reproductibilité
Fixer les critères d’acceptation avant les essais
Documenter pour que le dossier tienne à l’audit
Notre point de vue
Un matériau calibré pour vos essais
Un plan de validation en pratique
FAQ
Sources

Ce que valider veut vraiment dire

On entend parfois « validation » comme une formalité administrative de fin de projet. C’est plutôt la réponse à une question simple : pouvez-vous faire confiance au chiffre que votre méthode produit ? Le guide du Conseil canadien des normes sur la vérification et la validation des méthodes d’essai définit la validation comme la confirmation que les capacités et les caractéristiques de performance d’une méthode répondent aux exigences spécifiées, et qu’elle est adaptée à l’usage et à l’application prévus. Le même document précise que la portée de la validation doit être aussi étendue que l’application l’exige.

Autrement dit, il n’existe pas de validation universelle. Une méthode de dosage d’un alcaloïde dans une poudre de référence n’a pas les mêmes exigences qu’une méthode de dépistage de traces dans une matrice complexe. Ce qui compte, c’est l’adéquation entre ce que la méthode prouve et ce que vous, ou votre client, avez besoin de savoir.

La validation évalue en particulier la fiabilité d’une méthode d’essai (sa répétabilité), sa reproductibilité et sa capacité à produire des résultats corrects. Ces trois idées reviennent tout au long de cet article.

Un cycle de vie, pas un événement unique

L’ANSES, dans son guide de validation des méthodes d’analyses, décrit la vie d’une méthode comme un processus évolutif : sélection, développement, caractérisation au sein du laboratoire, validation, puis éventuellement revalidation périodique. Cette vision aide à planifier. Une méthode validée aujourd’hui peut devoir être réexaminée si l’instrument change, si la matrice évolue, si le matériau de référence est remplacé ou si l’usage se déplace.

Dans la pratique, trois déclencheurs justifient de rouvrir le dossier : une modification de la méthode (colonne, phase mobile, préparation d’échantillon), un changement du domaine d’application, et une dérive observée dans vos cartes de contrôle. Dans chaque cas, vous évaluez l’impact et vous répétez seulement les essais qui sont touchés, à condition de pouvoir justifier ce choix par écrit.

Validation ou vérification : où se situe la frontière

C’est l’une des questions les plus posées, et la réponse tient à l’origine de la méthode. Le guide Eurachem sur l’aptitude à l’emploi des méthodes (3e édition) rappelle que la validation démontre qu’une méthode est apte à l’usage, tandis que la vérification prouve qu’un laboratoire peut atteindre les performances déclarées d’une méthode déjà validée.

Concrètement, si vous développez votre propre méthode, ou modifiez de façon importante une méthode normalisée, vous validez. Si vous adoptez une méthode de pharmacopée ou une norme déjà validée, vous vérifiez que, dans vos mains, avec vos instruments et vos analystes, les performances annoncées sont atteintes. La vérification demande moins d’essais, mais pas moins de rigueur : un échec de vérification signifie que la méthode n’est pas prête dans votre laboratoire.

Le même guide souligne que l’évaluation des risques occupe désormais une place centrale dans la norme ISO/IEC 17025:2017. Plus le risque d’un résultat erroné est élevé pour l’utilisateur, plus l’étendue et la profondeur des études de validation ou de vérification doivent être grandes. Pour situer cette norme par rapport à celle qui encadre les producteurs de matériaux de référence, notre article sur ISO 17034 et ISO 17025 fait la différence.

Les critères de performance à évaluer

Le Conseil canadien des normes énumère les critères que l’on retrouve dans la plupart des plans de validation : la précision (répétabilité et reproductibilité), l’exactitude, la linéarité, les limites de détection et de quantification, le biais et l’incertitude. Toutes ne sont pas pertinentes pour chaque essai : on retient celles qui correspondent au type et à la visée de la méthode.

Le protocole DR-12-VMC du Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec, qui encadre la validation d’une méthode d’analyse en chimie, nomme des paramètres voisins : limite de détection de la méthode, limite de quantification de la méthode, fidélité (réplicabilité, répétabilité, reproductibilité), justesse, sensibilité et récupération. Les vocabulaires varient légèrement d’un document à l’autre, d’où l’intérêt de définir vos termes dans le plan de validation plutôt que de les supposer connus.

Exactitude et justesse

L’exactitude indique à quel point le résultat se rapproche de la valeur de référence. Pour la démontrer, les lignes directrices ICH Q2(R1) reprises par Santé Canada recommandent au minimum 9 déterminations réparties sur au moins 3 niveaux de concentration dans la plage spécifiée. Un matériau de référence certifié, avec son certificat d’analyse, est le point d’ancrage le plus direct pour ces essais, puisque sa valeur assignée est traçable.

Linéarité, limites de détection et de quantification

La linéarité établit sur quelle plage la réponse de l’instrument reste proportionnelle à la concentration. Les limites de détection et de quantification fixent le plus petit signal que vous pouvez distinguer du bruit, puis le plus petit que vous pouvez chiffrer avec une incertitude acceptable. Nous avons détaillé les calculs et les pièges courants dans notre guide LOD et LOQ en chimie analytique.

Pureté et sélectivité

Quand la méthode sert à évaluer la pureté d’un matériau, la séparation des composés voisins devient un critère à part entière. Notre flux de travail pour l’évaluation de la pureté par HPLC montre comment la documenter. Si la méthode doit aussi suivre la dégradation d’un produit dans le temps, la démarche décrite dans l’article sur les méthodes indicatrices de stabilité complète le plan.

Évaluer la répétabilité

La répétabilité répond à la question : si le même analyste refait la même mesure, avec le même instrument, dans la même séance, obtient-il le même résultat ? Selon les lignes directrices ICH Q2(R1) présentées par Santé Canada, elle s’évalue dans les mêmes conditions opératoires sur une courte période. Deux plans sont admis : 9 déterminations couvrant la plage spécifiée (3 concentrations, 3 réplicats chacune), ou au minimum 6 déterminations à 100 % de la concentration test.

Un exemple de déroulement : vous préparez six solutions indépendantes à la concentration cible à partir d’un même lot de matériau de référence, vous les injectez dans une même séquence, puis vous calculez la moyenne, l’écart-type et l’écart-type relatif. Ce dernier est comparé au critère d’acceptation que vous avez fixé avant l’essai. Le point important est « indépendantes » : six injections d’une seule solution mesurent la stabilité de l’instrument, pas la répétabilité de la méthode complète.

Certaines méthodes officielles fixent des seuils pratiques. La méthode du CEAEQ pour la détermination de la conductivité précise par exemple que les résultats de duplicatas ou de réplicats ne doivent pas différer de plus de 10 % lorsqu’ils dépassent au moins dix fois la limite de quantification. Ce seuil est propre à cette méthode : ne l’importez pas tel quel dans la vôtre sans justification.

Évaluer la reproductibilité

La reproductibilité change d’échelle. Elle demande si des laboratoires différents, avec des analystes et des instruments différents, arrivent au même résultat. Santé Canada, via l’ICH Q2(R1), indique qu’elle s’évalue au moyen d’un essai inter-laboratoires.

Les publications du Conseil national de recherches du Canada donnent des exemples concrets. Une étude inter-laboratoires de 2018 a confirmé la validité de deux protocoles d’analyse du soufre et des hémi-esters de sulfate, en montrant que les méthodes toléraient de légères variations. Pour repérer les laboratoires aberrants, elle a utilisé les statistiques h et k selon l’approche ASTM, qui signalent un écart excessif par rapport à la moyenne générale ou à l’écart-type global. L’incertitude de mesure y a été déterminée avec le moteur NIST Consensus Builder et la méta-analyse de DerSimonian-Laird.

En 2013, une étude du CNRC a validé la répétabilité et la reproductibilité du four tubulaire à état stable ISO/TS 19700 : trois séries de réplicats ont été réalisées dans plusieurs laboratoires, sur divers polymères. Autre variante : pour une méthode de mesure de rapports isotopiques du sélénium, la reproductibilité a été vérifiée en mesurant le matériau standard NIST SRM 3149 au cours de neuf sessions indépendantes réparties sur plusieurs jours. Toutes les reproductibilités n’exigent donc pas un réseau de laboratoires, mais une comparaison externe reste la preuve la plus convaincante. Si vous cherchez comment lire les scores d’une telle comparaison, notre article sur les comparaisons inter-laboratoires y revient.

Évaluer la reproductibilité — overview diagram

Fixer les critères d’acceptation avant les essais

Le piège le plus fréquent est de calculer les résultats d’abord et de décider ensuite ce qui est acceptable. Le Conseil canadien des normes demande l’inverse : les caractéristiques de performance et les critères d’acceptation doivent tenir compte de l’utilisation prévue et des besoins du client, et le laboratoire doit établir un plan de validation qui consigne les critères servant à juger l’aptitude à l’emploi.

Le guide Eurachem va dans le même sens : la validation doit être aussi complète que nécessaire pour répondre aux exigences de l’usage prévu. Un laboratoire qui sur-valide gaspille du temps et des matériaux. Un laboratoire qui sous-valide expose ses résultats à la contestation.

Le CCN ajoute un point pratique souvent oublié : l’étendue de la validation a un effet direct sur le temps et le coût, et elle doit faire l’objet d’un accord clair entre l’analyste et le client dès le début. Si vous travaillez pour un client interne ou externe, mettez cet accord par écrit avant la première injection.

Documenter pour que le dossier tienne à l’audit

Un bon dossier de validation se lit sans l’analyste. Il contient le but et le domaine d’application de la méthode, la description précise des étapes, le plan avec ses critères d’acceptation, les données brutes ou leur emplacement, les calculs, les écarts observés et la conclusion sur l’aptitude à l’emploi. Les essais qui échouent restent dans le dossier avec leur explication.

La traçabilité des matériaux compte autant que celle des données. Numéro de lot, certificat d’analyse, conditions de conservation et étiquetage doivent correspondre à ce qui a servi aux essais. Notre guide sur l’étiquetage « usage analytique seulement » et la liste de contrôle pour l’inspection des emballages aident à préparer cette partie avant une visite d’audit.

Notre point de vue

Chez nous, la validation commence avant la méthode : elle commence au flacon. Nous produisons en Colombie-Britannique des comprimés et des poudres de 7-hydroxymitragynine et de mitragynine, calibrés pour la recherche, accompagnés d’un certificat d’analyse et testés par des laboratoires tiers. Nous n’effectuons ni revente ni reconditionnement de sources inconnues, parce qu’un laboratoire ne peut pas démontrer l’exactitude de sa méthode avec un matériau dont il ne connaît pas l’origine.

Ce que nous voyons dans le travail de nos clients, c’est que la cohérence d’un lot à l’autre pèse autant que la teneur affichée. Une méthode peut être irréprochable et pourtant donner des résultats instables si le matériau de départ varie. C’est pourquoi nous proposons des formats calibrés, par exemple des comprimés de 15, 30 et 50 mg, qui servent de niveaux de concentration distincts pour les essais d’exactitude et de linéarité. Notre article sur les dosages de comprimés pour le COA et la validation détaille cette logique.

Nos produits sont destinés exclusivement à l’usage analytique et de laboratoire, jamais à la consommation humaine. Notre conseil : choisissez votre matériau de référence en même temps que vous rédigez le plan de validation, pas après.

— John

Un matériau calibré pour vos essais

Si votre plan de validation prévoit plusieurs niveaux de concentration, des essais de répétabilité sur un lot unique ou une vérification de reproductibilité entre deux sites, il vous faut un matériau constant et documenté. Nos comprimés et poudres de 7OH, de mitragynine, de MGM-15 et de SR17018 sont livrés au Canada avec leur certificat d’analyse, sans frais de douane puisqu’ils sont produits ici.

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Vous pouvez consulter l’ensemble de la gamme dans notre boutique de matériaux de recherche. Les prix sont affichés sur chaque fiche produit.

Un plan de validation en pratique

Pour passer de la théorie à la paillasse, voici l’ordre que suivent la plupart des laboratoires. D’abord, vous décrivez la méthode sans ambiguïté : réactifs, appareillage, préparation, séquence, calculs. Ensuite, vous définissez l’usage prévu et vous traduisez cet usage en critères d’acceptation chiffrés. Vous choisissez alors les paramètres pertinents parmi ceux vus plus haut, puis vous établissez le nombre d’essais, en vous appuyant sur les minima des lignes directrices applicables, comme les 9 déterminations sur 3 niveaux pour l’exactitude.

Vous réalisez ensuite les essais, de préférence dans l’ordre linéarité, exactitude, répétabilité, puis limites de détection et de quantification, car chaque étape confirme la plage de travail de la suivante. Vous traitez les résultats, vous les comparez aux critères et vous rédigez la conclusion. Enfin, vous planifiez la surveillance continue : cartes de contrôle, échantillons de contrôle qualité et déclencheurs de revalidation.

Étapes de validation et surveillance continue

Un dernier conseil de pragmatisme : gardez une marge entre vos résultats et vos critères. Une méthode qui passe de justesse sera la première à échouer le jour où un réactif ou un analyste change.

FAQ

Qu’est-ce que la validation d’une méthode analytique et comment se déroule-t-elle ?

C’est la démonstration, par des essais planifiés, que les performances de la méthode répondent aux exigences de l’usage prévu. Elle se déroule en quatre temps : plan et critères d’acceptation, essais sur les paramètres pertinents, comparaison des résultats aux critères, puis rapport de validation. Le plan est établi avant toute mesure.

Quelle est la différence entre la vérification et la validation ?

La validation démontre qu’une méthode est apte à l’usage, ce qui s’applique à une méthode nouvelle ou modifiée. La vérification prouve que votre laboratoire atteint les performances déclarées d’une méthode déjà validée. Elle demande moins d’essais, mais ses critères de réussite restent stricts.

Combien de déterminations faut-il pour la répétabilité ?

Les lignes directrices ICH Q2(R1) reprises par Santé Canada proposent 9 déterminations sur la plage spécifiée, soit 3 concentrations en 3 réplicats, ou au minimum 6 déterminations à 100 % de la concentration test. Ce sont des minima : votre plan peut en exiger davantage selon le risque.

Comment démontrer la reproductibilité d’une analyse chimique ?

La voie reconnue est l’essai inter-laboratoires, où plusieurs laboratoires analysent les mêmes échantillons et où l’on compare leurs résultats avec des outils statistiques. Des études du CNRC ont aussi vérifié la reproductibilité par des sessions de mesure indépendantes d’un matériau standard sur plusieurs jours.

Faut-il revalider une méthode ?

Oui, lorsque la méthode, l’instrument, la matrice ou l’usage changent, ou lorsque vos contrôles qualité dérivent. L’ANSES inclut d’ailleurs la revalidation périodique dans le cycle de vie d’une méthode. L’ampleur de la revalidation dépend de l’impact évalué.

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